Классификация питательных сред производится по их составу и назначению. Классификация питательных сред по назначению, их примеры К специальным питательным средам относят

При приготовлении питательных сред необходимо учитывать потребность культивируемых микроорганизмов в различных элементах питания. Существует различные классификации питательных сред.

Классификация питательных сред по составу:

1. Простые среды (МПБ, МПА, желатин, пептонная вода). Мясо-пептонный бульон (МПБ) является белковой основой всех сред. Существует несколько способов приготовления МПБ:

а) на мясной воде с добавлением готового пептона;

б) на переварах продуктов гидролиза исходного сырья при помощи ферментов.

Мясо-пептонный агар (МПА) – получают путем добавления arap-arapa (l,5-3%)к МПБ. Если МПА распределен по диагонали пробирки или флакона – это скошенный агар. Если среда распределе­на в пробирке вертикально высотой 5-7 см, это агар столбиком. МПА, застывший в чашках Петри в виде пластинки – пластинчатый агар. Если среда имеет вертикальный слой высотой 2-3 см, и диагональный слой такой же величины, это полускошенный агар.

2. Сложные среды готовятся на основе простых с определенными добавками (углеводы, кровь, желчь, яйца, сыворотка, молоко, соли, факторы роста и т.п.)

Классификация питательных сред по исходным компонентам:

1.Естественные питатель­ные среды - это натуральный продукт животного или ра­стительного происхождения. Могут быть:

· Растительные (исходные продукты – соя, горох, картофель, морковь и т.п.)

· Животные (исходные продукты – мясо, рыба, яйца, молоко, жи­вотные ткани, желчь, сыворотка крови.и т.п.)

· Смешанные (МПА, среда Левенштейна – Йенсена и т.п.)

2. Искусственные среды содержат переработанные естественные продукты (мясную воду, перевар), вещества, полученные из этих продуктов (пептон, дрожжевой и кукурузный экстракты) и различные добавки. Это самая большая и разнообразная по составу наиболее часто применяемая группа сред. Их готовят по определенным рецептам из различных настоев или отваров животного или растительного про­исхождения с добавлением неорганических солей, угле­водов и азотистых веществ.

3. Синтетические среды (известного химического состава) состоят из химически чистых соединений в точно установленных концентрациях (с добавлением углеводов, солей, аминокислот, витаминов и т.п.). На основе этих сред, добавляя к ним естественные или искусственные среды получают полусинтетические среды.

Классификация питательных сред по консистенции: среды бывают жидкие (среды без агара), полу­жидкие (с агаром до 1%), плотные (агаровые – 1,5-2,5%). Жидкие среды чаще применяют для изучения физиолого-биохимических осо­бенностей микроорганизмов, для накопления биомассы и продуктов обмена. Полужидкие среды обычно использу­ют для хранения культур, плотные - для выделения микроорганизмов, изучения морфологии колоний, диагно­стических целей, количественного учета, определения ан­тагонистических свойств и др.

Классификация питательных сред по целевому назначению: универсальные (общеупотребительные) и специальные.

Универсальные (основные) среды. Эти среды используют для культивирования большинства относительно неприхотливых микроорганизмов или применяют в качестве основы для приготовления специальных сред, добавляя к ним кровь, сахар, молоко, сыворотку и другие ингредиенты, необходи­мые для размножения того или иного вида микроорганизмов.К этой группе отно­сятся: МПБ – мясо-пептонный бульон, МПА - мясо-пептонный агар, МПЖ – мясо-пептонный желатин и т.п.

Специальные среды. Предназначены для выделения и избирательного культивирования определенных видов микроорганизмов, которые не растут на простых средах.

Различают следующие виды специальных сред: среды обогащения, элективные, дифференциально-диагностические, консервирующие и среды накопления.

1. Среды обогащения. Многие микроорганизмы не растут на обычных средах, поэтому для повышения питательной ценности среды в нее добавляют углеводы (сахарный бульон или агар) или белки (сывороточный агар и бульон, кровяной агар и бульон).Кровяной агар или кровяной бульон – получают путем добавле­ния к питательной среде 5-10% подогретой стерильной дефибринированной крови барана, кролика, лошади, человека. Среда используется для выделения стрептококков, пневмококков и других бактерий, а также для изучения гемолитической активности. Сывороточный бульон или сывороточный агар получают, путем добавления к простым средам 15-20% лошадиной или бычьей сыворотки.

2. Элективные (избирательные) среды. Эти среды предназначены для избирательного выделения и накопления микроорганизмов определенного вида из материала, содержащего несколько видов микробов. При посеве на них материала, содержащего смесь раз­личных микроорганизмов, раньше всего будет проявлять­ся рост того вида, для которого данная среда будет электив­ной. Избирательность среды достигается путем создания условий, оптимальных для культивирования определенных микробов (рН, Eh, концентрация солей, состав питательных веществ), т.е. положительной селекцией. Или путем добавления в среду веществ, угнетающих другие микроорганизмы (желчь, высокие концентрации NaCl, антибиотики и др.), т.е. отрицательной селекцией. К этой группе относятся:

Селенитовая среда - является лучшей средой обогащения для сальмонелл и дизентерийных микробов Зонне. Селенит натрия, содержащийся в среде, стимулирует рост этих бактерий и подавляет рост сопутствующей флоры.

Висмут-сульфит агар – содержит соли висмута, бриллиантовую зелень. Сальмонеллы растут на этой среде в виде колоний черного цвета. Другие виды бактерий на этой среде роста не дают.

Желточно-солевой агар (ЖСА) –среда для выделе­ния стафилококков, содержит до 10% хлорида натрия, что подавляет большинство бактерий, содержащихся в материале. Кроме того, эта сре­да является и дифференциально-диагностической, так как присутствие яичного желтка позволяет выявить фермент лецитиназу (лецитовителлазу), который образуют патогенные стафилококки. Лецитиназа расщеп­ляет лецитин на фосфорхолины и нерастворимые в воде жирные кисло­ты, поэтому среда вокруг лецитиназоположительных колоний мутнеет и появляется опалесцирующая зона в виде «радужного венчика».

Желчный бульон элективен для сальмонелл, размножение которых стимулирует добавленная 10% желчь, одновременно тормозящая рост сопутствующих микроорганизмов.

Щелочной агар или щелочная пептонная вода элективны для холерных вибрионов, щелочная реакция среды (рН 9,0) не препятствует росту холерных вибрионов, но тормозит рост других микроорганизмов.

3. Дифференциально-диагностические среды. Дифференциально-диагностические среды применяют для дифференцировки одного вида микроорганизмов от другого по характеру их ферментативной активности. Состав этих сред подбирают с таким расчетом, чтобы четко выявить наиболее характерные свойства определенного вида микроорганизмов, основываясь на особенностях его обмена веществ.

· Среды для выявления протеолитической и гемолитической способности микробов, содержащие в своем составе бел­ковые вещества: кровь, молоко, желатин и т. п. Наиболее распространенными средами являются мясо-пептонный желатин (МПЖ) свернувшаяся лошадиная сыворотка, молоко и кровяной агар (КА).

· Среды для изучения гликолитических свойств включают три основных компонента: питательная основа (бульон, агар), субстрат (моно- и дисахара, многоатомные спирты) и индикатор для выявления соответствующих ферментов. Ферментативное расщепление субстратов приводит к сдвигу рН и изменению окрас­ки среды. Наиболее распространены цветные среды с различными угле­водами (например, с бромтимоловым синим, индикатором BP). Также широко распространены среды Гисса, на которых учитывают различия в способности ферментировать различные углеводы с образованием кислоты, либо кислоты и газа. Для дифференцировки энтеробактерий применяют пептонную воду с набором различных углеводов, индикатором Андреде и поплавками, облегчающи­ми обнаружение газообразования и помогающие визуально определить изменение рН, характерное для различных микроорганизмов. В частности, сдвиг в кислую сторону вызывает покрас­нение среды с реактивом Андреде или пожелтение при использовании среды с бромтимоловым синим, тогда как при защелачивании индикатор Андреде и бромтимоловый синий не меняют цвет среды. Например, для выделе­ния патогенных бактерий из кишечника применяют среды, которые позво­ляют дифференцировать патогенные микроорганизмы от постоянных оби­тателей кишечника - микроорганизмов, разлагающих лактозу. Такой сре­дой является среда Эндо. Основными компонентами среды Эндо являются МПА, лактоза и основной фуксин, обесцвеченный сульфитом натрия. Исходная питательная среда окраше­на в светло-розовый цвет. При сбраживании лактозы образуется ацетальдегид, который реагирует с сульфитом и, высвободившийся при этом, фуксин окрашивает колонии в ярко-крас­ный цвет. Поэтому кишечная палочка, которая сбраживает лактозу, при росте на этой среде образует красные колонии с металлическим блес­ком, а сальмонеллы и шигеллы - бесцветные, так как они не сбраживают лактозу.

4. Среды накопления, на которых происходит быстрый рост определенных видов микроорганизмов.

5. Консервирующие (транспортные) среды. Предназначены для сохранения микроорганизмов во время транспортировки к месту исследования. Этисреды, содержат добавки, предупреждающие размножение и гибель микробов, что способствует сохранению их жизнеспособности. Наибольшее применение нашли глицериновая смесь (среда Тига), фосфатно-буферная смесь и среды Кари-Блэйра, Амиеса (с активированным углем и без активированного угля), Стюарта и др.

Стерилизация питательных сред. Все питательные среды независи­мо от их назначения разливают в чистую посуду и стери­лизуют. Большинство сред стерилизуют автоклавированием, но при различных режимах в зависимости от их со­става.

1. Синтетические среды и все агаровые среды, не содер­жащие в своем составе нативного белка и углеводов, стери­лизуют 15-20 мин в автоклаве при температуре 115-120°С и давлении 1-1,5 атмосферы.

2. Среды с углеводами и молоком (в состав которого вхо­дит лактоза), питательный желатин стерилизуют текучим паром при температуре 100°С дробно или в автоклаве при 112°С и при давлении до 1 атмосферы.

3. Среды, в состав которых входят белковые вещества (сыворотка крови, асцитическая жидкость), обеспложивают­ся тиндализацией или фильтрованием.

4. Для стерилизации питательных сред, содержащих в своем составе нативные белки, пользуются фильтрацией че­рез мембранные фильтры Зейтца.

Для контроля стерильности среды после стерилизации помещают в термостат при 37°С на 3-5 сут. Жидкие среды должны оставаться прозрачными, а на поверхности и в толще плотных питательных сред не должны появляться признаки роста. Кроме контроля стерильности, произво­дят химический контроль готовых сред, который заклю­чается в том, что в нескольких образцах каждой серии определяют рН, количество общего и аминного азота и хлоридов.

Существует также биологический контроль сред. В этом случае несколько образцов среды засевают лабо­раторной культурой того микроба, для которого приготовлена среда, и изучают характер его роста. Только после того, как среды выдержали контроль, их можно использовать по назначению.

Асептика и антисептика

Асептика - комплекс профилактических мероприятий, направленных на предотвращение попадания микроорганизмов в какой-либо объект: рану, операционное поле, стерильный раствор или лекарственный препарат. Она включает:

1) стерилизацию инструментов, приборов, материалов;

2) специальную (антисептическую) обработку рук перед асептичной работой;

3) соблюдение определенных правил и приёмов работы (стерильный халат, маска, перчатки, исключение разговоров и т.п.);

4) осуществление специальных санитарно-противоэпидемических и гигиенических мероприятий (правильная вентиляция, влажная уборка с применением дезинфицирующих средств, использование бактерицидных облучателей, боксированных помещений).

Антисептика - это комплекс мероприятий, направленных на уничтожение микробов, попавших в рану, лекарственный препарат или другой объект. Различают антисептику:

1) механическую (например, при обработке раны удаление из нее инфицированных и нежизнеспособных тканей, инородных тел);

2) физическую (наложение гигроскопических повязок, дренирование ран, применение гипертонических растворов, способствующих оттоку раневого отделяемого в повязку, сухого тепла, УФО, лазера);

3) химическую (применяют химические вещества, обладающие бактерицидными или бактериостатическим действием при минимальном органотропном действии, например, этиловый спирт, перекись водорода, мирамистин или хлоргексидин; в лекарственные препараты вносят борную кислоту, мертиолят и др.);

4) биологическую (использование протеолитических ферментов для лизиса нежизнеспособных кле­ток, применение антибиотиков, бактериофагов, иммуноглобулинов, средств, стимулирующих защитные силы организма).

Питательные среды в микробиологии - это субстраты, на которых выращивают микроорганизмы и тканевые культуры. Они применяются для диагностических задач, выделения и изучения чистых культур микроорганизмов, получения вакцин и лекарств, для других биологических, фармацевтических и медицинских целей.

Классификация микробиологических питательных сред

В микробиологии питательные среды разделяют на:
- среды определенного и неопределенного состава;
- натуральные, полусинтетические и синтетические;
- основные, диагностические, элективные;
- плотные, полужидкие, жидкие, сухие, сыпучие.

Натуральными питательными средами называют те, что получают из природных материалов: крови, мяса, белков, органов животных, растительных экстрактов и растительного сырья. Примером таких сред могут быть мясной бульон, молочная сыворотка, пивное сусло, настои сена, агар-агар , кровь, желчь. Натуральные среды относятся к средам с неопределенным составом, который в разное время могут иметь разное количество тех или иных компонентов.

Полусинтетические среды тоже считаются средами с неопределенным составом. Они готовятся на основе натуральных питательных сред, но в них добавляются вещества, которые гарантируют культурам активное размножение. На полусинтетических средах выращивают культуры для получения витаминов, аминокислот, антибиотиков в промышленной фармацевтике.

Синтетические среды готовят из ингредиентов известного состава, в известной концентрации и соотношениях, поэтому эти среды относятся к средам определенного состава. С их помощью изучают метаболизм микроорганизмов, их биологические и физиологические свойства, возможность получения веществ, подавляющих или, наоборот, стимулирующих их развитие.

Основные, элективные и диагностические питательные среды

Основные среды служат для выращивания различных микробных культур, а также как основа для получения элективных и диагностических сред. К основным средам, например, относится мясной бульон, мясной агар, сусло, бульон Хоттингера. Для разных культур в основные среды добавляют некоторые компоненты для стимулирования роста - это могут быть витамины, аминокислоты, природные экстракты. Так, возбудитель коклюша выращивается на среде с добавлением крови.

Элективные среды - среды для избирательного (селективного) выращивания биологических культур. Состав среды подбирается так, чтобы быть оптимальным для одного вида или группы близкородственных бактерий и подавлять развитие бактерий других видов. Например, добавление в среду хлористого натрия в определенной концентрации подавляет рост всех бактерий, кроме стафилококков. С помощью элективных культур получают чистые культуры для дальнейшего размножения и накопления.

Диагностические среды служат для идентификации микроорганизмов. По изменению среды и ее химического состава (изменению окраски среды, появлению пузырьков газа и т.п.) определяют вид бактерий. В такие среды часто добавляют химические красители-индикаторы, такие как кристаллический фиолетовый , малахитовый зеленый, метиленовый синий , фусин и другие. Они помогают разделить близкие культуры. Скажем, в розовой среде Эндо, подкрашенной фусином, кишечная палочка образует колонии красного цвета, а тифозные и дизентерийные колонии бактерий - бесцветные.

При приготовлении питательных сред необходимо учитывать потребность культивируемых микроорганизмов в различных элементах питания. Существует различные классификации питательных сред.

Классификация питательных сред по составу:

1. Простые среды (МПБ, МПА, желатин, пептонная вода). Мясо-пептонный бульон (МПБ) является белковой основой всех сред.

Существует несколько способов приготовления МПБ:

а) на мясной воде с добавлением готового пептона;

б) на переварах продуктов гидролиза исходного сырья при помощи ферментов.

Мясо-пептонный агар (МПА) — получают путем добавления агар-агара (1,5-3%) к МПБ. Если МПА распределен по диагонали пробирки или флакона — это скошенный агар. Если среда распределена в пробирке вертикально высотой 5-7 см, это агар столбиком. МПА, застывший в чашках Петри в виде штастшки — пластинчатый агар. Если среда имеет вертикальный слой высотой 2-3 см, и диагональный слой такой же величины, это полускошенный агар.

2. Сложные среды готовятся на основе простых с определенными добавками (углеводы, кровь, желчь, яйца, сыворотка, молоко, соли, факторы роста и т.п.)

Классификация питательных сред по исходным компонентам:

1. Естественные питательные среды — это натуральный продукт животного или растительного происхождения.

Могут быть:

Растительные (исходные продукты — соя, горох, картофель, морковь и т.п.).

Животные (исходные продукты — мясо, рыба, яйца, молоко, животные ткани, желчь, сыворотка крови и т.п.).

Смешанные (МПА, среда Левенштейна - Йенсена и т.п.).

2. Искусственные среды содержат переработанные естественные продукты (мясную воду, перевар), вещества, полученные из этих продуктов (пептон, дрожжевой и кукурузный экстракты) и различные добавки. Это самая большая и разнообразная по составу наиболее часто применяемая группа сред. Их готовят по определенным рецептам из различных настоев или отваров животного или растительного происхождения с добавлением неорганических солей, углеводов и азотистых веществ.

3. Синтетические среды (известного химического состава) состоят из химически чистых соединений в точно установленных концентрациях (с добавлением углеводов, солей, аминокислот, витаминов и т.п.). На основе этих сред, добавляя к ним естественные или искусственные среды, получают полусинтетические среды.

Классификация питательных сред по консистенции: среды бывают жидкие (среды без агара), полужидкие (с агаром до 1%), плотные (агаровые — 1,5-2,5%). Жидкие среды чаще применяют для изучения физиолого-биохимических особенностей микроорганизмов, для накопления биомассы и продуктов обмена. Полужидкие среды обычно используют для хранения культур, плотные — для выделения микроорганизмов, изучения морфологии колоний, диагностических целей, количественного учета, определения антагонистических свойств и др.

Классификация питательных сред по целевому назначению: универсальные (общеупотребительные) и специальные.

Универсальные (основные) среды. Эти среды используют для культивирования большинства относительно неприхотливых микроорганизмов или применяют в качестве основы для приготовления специальных сред, добавляя к ним кровь, сахар, молоко, сыворотку и другие ингредиенты, необходимые для размножения того или иного вида микроорганизмов. К этой группе относятся: МПБ — мясо-пептонный бульон, МПА — мясо-пептонный агар, МПЖ — мясо-пептонный желатин и т.п.

Специальные среды. Предназначены для выделения и избирательного культивирования определенных видов микроорганизмов, которые не растут на простых средах.

Различают следующие виды специальных сред: среды обогащения, элективные, дифференциально-диагностические, консервирующие и среды накопления.

Среды обогащения. Многие микроорганизмы не растут на обычных средах, поэтому для повышения питательной ценности среды в нее добавляют углеводы (сахарный бульон или агар) или белки (сывороточный агар и бульон, кровяной агар и бульон). Кровяной агар или кровяной бульон — получают путем добавления к питательной среде 5-10% подогретой стерильной дефибринированной крови барана, кролика, лошади, человека. Среда используется для выделения стрептококков, пневмококков и других бактерий, а также для изучения гемолитической активности. Сывороточный бульон или сывороточный агар получают, путем добавления к простым средам 15-20% лошадиной или бычьей сыворотки.

2. Элективные (избирательные) среды. Эти среды предназначены для избирательного выделения и накопления микроорганизмов определенного вида из материала, содержащего несколько видов микробов. При посеве на них материала, содержащего смесь различных микроорганизмов, раньше всего будет проявляться рост того вида, для которого данная среда будет элективной. Избирательность среды достигается путем создания условий, оптимальных для культивирования определенных микробов (рН, Еh, концентрация солей, состав питательных веществ), т.е. положительной селекцией. Или путем добавления в среду веществ, угнетающих другие микроорганизмы (желчь, высокие концентрации NаС1, антибиотики и др.), т.е. отрицательной селекцией. К этой группе относятся:

Селенитовая среда — является лучшей средой обогащения для сальмонелл и дизентерийных микробов Зонне. Селенит натрия, содержащийся в среде, стимулирует рост этих бактерий и подавляет рост сопутствующей флоры.

Висмут-сульфит агар — содержит соли висмута, бриллиантовую зелень. Сальмонеллы растут на этой среде в виде колоний черного цвета. Другие виды бактерий на этой среде роста не дают.

Желточно-солевой агар (ЖСА) — среда для выделения стафилококков, содержит до 10% хлорида натрия, что подавляет большинство бактерий, содержащихся в материале. Кроме того, эта среда является и дифференциально-диагностической, так как присутствие яичного желтка позволяет выявить фермент лецитиназу (лецитовителлазу), который образуют патогенные стафилококки. Лецитиназа расщепляет лецитин на фосфорхолины и нерастворимые в воде жирные кислоты, поэтому среда вокруг лецитиназоположительных колоний мутнеет и появляется опалесцирующая зона в виде «радужного венчика».

Желчный бульон элективен для сальмонелл, размножение которых стимулирует добавленная 10% желчь, одновременно тормозящая рост сопутствующих микроорганизмов.

Щелочной агар или щелочная пептонная вода элективны для холерных вибрионов, щелочная реакция среды (рН 9,0) не препятствует росту холерных вибрионов, но тормозит рост других микроорганизмов. 3-5 сут. Ж

3. Дифференциально-диагностические среды. Дифференциально-диагностические среды применяют для дифференцировки одного вида микроорганизмов от другого по характеру их ферментативной активности. Состав этих сред подбирают с таким расчетом, чтобы четко выявить наиболее характерные свойства определенного вида микроорганизмов, основываясь на особенностях его обмена веществ.

Среды для выявления протеолитической и гемолитической способности микробов, содержащие в своем составе белковые вещества: кровь, молоко, желатин и т.п. Наиболее распространенными средами являются мясо-пептонный желатин (МПЖ) свернувшаясялошадиная сыворотка, молоко и кровяной агар (КА).

Среды для изучения гликолитических свойств включают три основных компонента: питательная основа (бульон, агар), субстрат (моно- и дисахара, многоатомные спирты) и индикатор для выявления соответствующих ферментов. Ферментативное расщепление субстратов приводит к сдвигу рН и изменению окраски среды. Наиболее распространены цветные среды с различными углеводами (например, с бромтимоловым синим, индикатором ВР). Также широко распространены среды Гисса, на которых учитывают различия в способности ферментировать различные углеводы с образованием кислоты, либо кислоты и газа.

Для дифференцировки энтеробактерий применяют пептонную воду с набором различных углеводов, индикатором Андреде и поплавками, облегчающими обнаружение газообразования и помогающие визуально определить изменение рН, характерное для различных микроорганизмов. В частности, сдвиг в кислую сторону вызывает покраснение среды с реактивом Андреде или пожелтение при использовании среды с бромтимоловым синим, тогда как при защелачивании индикатор Андреде и бромтимоловый синий не меняют цвет среды. Например, для выделения патогенных бактерий из кишечника применяют среды, которые позволяют дифференцировать патогенные микроорганизмы от постоянных обитателей кишечника — микроорганизмов, разлагающих лактозу.

Такой средой является среда Эндо. Основными компонентами среды Эндо являются МПА, лактоза и основной фуксин, обесцвеченный сульфитом натрия. Исходная питательная среда окрашена в светло-розовый цвет. При сбраживании лактозы образуется ацетальдегид, который реагирует с сульфитом и, высвободившийся при этом, фуксин окрашивает колонии в ярко-красный цвет. Поэтому кишечная палочка, которая сбраживает лактозу, при росте на этой среде образует красные колонии с металлическим блеском, а сальмонеллы и шигеллы — бесцветные, так как они не сбраживают лактозу .

4. Среды накопления, на которых происходит быстрый рост определенных видов микроорганизмов.

5. Консервирующие (транспортные) среды. Предназначены для сохранения микроорганизмов во время транспортировки к месту исследования. Эти среды, содержат добавки, предупреждающие размножение и гибель микробов, что способствует сохранению их жизнеспособности. Наибольшее применение нашли глицериновая смесь (среда Тига), фосфатно-буферная смесь и среды Кари-Блэйра, Амиеса (с активированным углем и без активированного угля), Стюарта и др.

Стерилизация питательных сред.

Все питательные среды независимо от их назначения разливают в чистую посуду и стерилизуют. Большинство сред стерилизуют автоклавированием, но при различных режимах в зависимости от их состава.

1. Синтетические среды и все агаровые среды, не содержащие в своем составе нативного белка и углеводов, стерилизуют 15-20 мин в автоклаве при температуре 115-120°С и давлении 1-1,5 атмосферы .

2. Среды с углеводами и молоком (в состав которого входит лактоза), питательный желатин стерилизуют текучим паром при температуре 100°С дробно или в автоклаве при 112°С и при давлении до 1 атмосферы.

3. Среды, в состав которых входят белковые вещества (сыворотка крови, асцитическая жидкость), обеспложиваются тиндализацией или фильтрованием.

4. Для стерилизации питательных сред, содержащих в своем составе нативные белки, пользуются фильтрацией через мембранные фильтры Зейтца.

Для контроля стерильности среды после стерилизации помещают в термостат при 37°С на 3-5 сут. Жидкие среды должны оставаться прозрачными, а на поверхности и в толще плотных питательных сред не должны появляться признаки роста. Кроме контроля стерильности, про-изводят химический контроль готовых сред, который заключается в том, что в нескольких об-разцах каждой серии определяют рН, количество общего и аминного азота и хлоридов.

Существует также биологический контроль сред. В этом случае несколько образцов среды засевают лабораторной культурой того микроба, для которого приготовлена среда, и изучают характер его роста. Только после того, как среды выдержали контроль, их можно использовать по назначению.

Питательные среды классифицируют в зависимости от исходных компонентов, консистенции, целевого назначения, химического состава.

В зависимости от химического состава и исходных компонен­тов различают следующие типы питательных сред.

Среды неопределенного химического состава. Их подразделяют на: 1) среды животного происхождения (исходные продукты - мясо, рыба, яйца, молоко и т.д.); 2) среды растительного проис­хождения (исходные продукты - соя, горох, картофель, морковь и т.д.).

Некоторые продукты используют в натуральном виде (карто­фель, морковь, молоко и т. д.), но чаще животные и раститель­ные ткани подвергают различной обработке (экстрагированию, ферментативному или кислотному гидролизу).

Среды известного химического состава (синтетические). В них входят известные химические соединения (соли, углеводы, амино­кислоты, витамины и т. д.) в оптимальном количественном соот­ношении. Синтетические питательные среды используют, когда выращиваемую клеточную массу необходимо максимально осво­бодить от балластных органических соединений, входящих в со­став обычных сред, например при получении диагностических ал­лергенов или при изучении метаболических потребностей микро­организма в том или ином конкретном химическом соединении.

По консистенции питательные среды дифференцируют на плотные, полужидкие и жидкие.

Жидкие питательные среды. Готовят, используя экстракты, гидролизаты, растворы исходных продуктов.

Полужидкие и плотные питательные среды . Необходимую кон­систенцию среде придают добавлением различных уплотнителей.

Агар-агар (малайское желе) - полисахарид, продукт пе­реработки некоторых морских водорослей. Плавится при 80...86 ºС, затвердевает при 40 ºС. Для получения плотных сред его добавляют в количестве 1,5...2%, реже 3 %; полужидких - 0,3...0,7%.

Желатина - экстракт из тканей, содержащих много кол­лагена (кости, хрящи, сухожилия и т.д.). Желатиновый гель пла­вится при 25 °С, что делает его неудобным для выращивания микроорганизмов с температурным оптимумом 37...38 °С. Кроме того, ряд бактерий выделяют протеолитические ферменты, раз­лагающие желатину. Обычно в питательные среды вносят 10...20 % желатины.

По целевому назначению различают общеупотребительные (ос­новные), обогащенные, специальные, элективные (избиратель­ные) и дифференциально-диагностические питательные среды.

Общеупотребительные (основные) среды . Их применяют для культивирования относительно неприхотливых микроорганиз­мов.

В качестве исходных компонентов для приготовления основ­ных сред используют наиболее часто мясную воду, перевар Хоттингера, растительные гидролизаты.

Мясная вода: говядину освобождают от костей, жира, сухожилий, пропускают через мясорубку. Мясной фарш залива­ют водопроводной водой в соотношении 1: 2, кипятят 1 ч. После кипячения мясную воду охлаждают, фильтруют через ватно-мар-левый фильтр, затем доливают водопроводной водой до первона­чального объема, разливают по емкостям, закрывают ватно-мар-левыми пробками и стерилизуют при 120 °С 20 мин.

Перевар Хоттингера готовят из мясных отходов пу­тем их триптического гидролиза. Жир, фасции, сухожилия мелко нарезают, заливают кипящей водой в соотношении 1:2, кипятят, охлаждают до 45 °С и добавляют панкреатин, подщелачивают ра­створом карбоната натрия до рН 7,8...8,0, встряхивают и добавля­ют хлороформ (10 мл/л), плотно закрывают, выдерживают в теп­лом месте 10 дней, получают продукт гидролиза (перевар).

Мясо-пептонный бульон (МПБ). К 1 л мясной воды добавляют 1 % пептона и 0,5 % хлорида натрия, устанавли-

Рис. 32. Приготовление скошенного агара

вают необходимый рН дробным добавлением 10%-го раствора гидроксида натрия или гидроксида калия. Фильтруют через бу­мажный фильтр, разливают по колбам, пробиркам и стерилизуют при 120 "С 15...20 мин.

Мясо-пептонный агар (МПА): к МПБ добавляют 2...3 % промытого мелко нарезанного агар-агара, нагревают до расплавления агара, доводят до кипения, в горячем виде прове­ряют рН, затем, если необходимо, доводят его до нужного значе­ния (7,2...7,6), фильтруют через ватно-марлевый фильтр. Про­фильтрованный горячий агар разливают по пробиркам и колбам, стерилизуют автоклавированием при 1 атм 20...30 мин. Чтобы по­лучить скошенную поверхность агара, удобную для посева, после стерилизации пробирки с расплавленным МПА оставляют при комнатной температуре до уплотнения в наклонном положении (конец с пробкой приподнят) (рис. 32).

Широко используют культивирование микроорганизмов на плотных питательных средах в чашках Петри. Диаметр стандарт­ной чашки Петри (рис. 33) около 10 см, выпускают чашки мень­шего и большего диаметров, а также одноразовые пластиковые. В

стандартные стерильные чашки Петри над пламенем горелки на­ливают около 20 мл расплавленного и охлажденного до 45...50 "С питательного агара, чашки помещают на горизонтальную по­верхность до застывания агара.

Полужидкий мясо-пептонный агар (ПЖА) готовят, как МПА, но добавляют 0,25 % агара. Кипятят при по­мешивании до полного расплавления агара, устанавливают рН 7,2...7,6, фильтруют в горячем виде, стерилизуют в автоклаве.

Мясо-пептонная желатина (МПЖ): к МПБ до­бавляют 10...20% измельченной желатины, нагревают до рас­плавления уплотнителя, устанавливают рН 7,2...7,4, кипятят, фильтруют через ватно-марлевый фильтр, разливают по пробир­кам и стерилизуют дробно в аппарате Коха три дня по 20 мин или однократно в автоклаве при 112°С 15 мин.

Бульон Хоттингера: основной перевар Хоттингера разводят водопроводной водой в соотношении 1:5 (1:8) до со­держания аминного азота 120 мг%, добавляют 0,5% хлорида на­трия, 0,1 г гидрофосфата калия, устанавливают рН 7,4...7,6, кипя­тят 15...20 мин, фильтруют через ватно-марлевый или бумажный фильтр, разливают по емкостям и стерилизуют при 120 °С 20...30 мин.

Агар Хоттингера готовят, добавляя к бульону Хот­тингера 2 % агар-агара.

Предприятия биологической промышленности выпускают го­товые питательные бульон и агар в виде сухого порошка.

Питательный бульон содержит (г/л): триптический гидролизат кильки - 10,05, хлорид натрия - 4,95. Навеску по­рошка массой 15 г растворяют в 1 л дистиллированной воды, ки­пятят 2 мин, фильтруют через бумажный фильтр, разливают по емкостям и стерилизуют в автоклаве при 120 ºС 20 мин (рН 7,3).

Питательный агар содержит (г/л): ферментативный гидролизат кормовых дрожжей - 12,0; агар- 12,5; хлорид на­трия - 5,5. Навеску порошка массой 36 г растворяют в 1 л дис­тиллированной воды, кипятят 3 мин, фильтруют через ватный фильтр, стерилизуют при 120 "С 20 мин (рН 7,3).

Обогащенные среды. Многие виды болезнетворных бактерий плохо растут на общеупотребительных питательных средах, по­этому в основные среды добавляют кровь, сыворотку крови, уг­леводы и т. д. Такие питательные среды получили название обо­гащенных.

Сывороточный и кровяной агары: к рас­плавленному и охлажденному до 45...50°С стерильному пита­тельному агару добавляют 5...10% стерильной дефибринирован-ной крови барана (кролика) или сыворотки крови (лошади, круп­ного рогатого скота, кролика). Для получения дефибринирован-ной крови у барана кровь берут асептично из яремной вены стерильной иглой в стерильный флакон (или колбочку) со стек­лянными (фарфоровыми) бусами или шариками, встряхивают вращательными движениями 15...20 мин, чтобы предотвратить свертывание крови. Фибрин остается на бусах.

Компоненты перемешивают, разливают в чашки Петри, про­бирки и оставляют до застывания питательной среды.

Сывороточный и кровяной бульоны гото­вят аналогичным образом.

Растворы углеводов (глюкоза и др.) стерилизуют текучим паром или фильтрованием и добавляют в количестве 0,5... 1 % к питательной среде.

Специальные среды . Так называют среды, разработанные с уче­том специфических ростовых потребностей ряда бактерий. На­пример, желточная среда Мак-Коя для возбудителя туляремии, среда Терских для культивирования лептоспир и др.

Среда Мак-Коя: чистые куриные яйца обрабатывают спиртом, быстро проводят через пламя горелки. Стерильно вскрывают, желтки отделяют от белков. К 60 частям желтков добавляют 40 частей физиологического раствора (рН 7,0...7,2). Компоненты перемешивают, разливают в пробирки по 4...5 мл и помещают в наклонном положении в аппарат для свертыва­ния сыворотки. Стерилизуют в первый день при 75 °С 1 ч, на второй день при 85 °С 30 мин. Для контроля стерильности при­готовленные среды выдерживают 2 сут в термостате при 37...38 °С.

Среда Терских состоит из фосфатной смеси Зеренсе-на и кроличьей сыворотки. Смесь Зеренсена: раствор А: гидро­фосфат натрия - 11,876 г, вода дистиллированная - 1000 мл; ра­створ Б: дигидрофосфат калия - 9,078 г, вода дистиллирован­ная - 1000 мл. К 90 мл раствора А добавляют 10 мл раствора Б и доводят объем дистиллированной водой до 1000 мл. Раствор раз­ливают в пробирки по 5 мл, стерилизуют при 1,5 атм 20 мин. В каждую пробирку добавляют шесть-восемь капель стерильной инактивированной при 56 °С сыворотки кролика.

Элективные среды (лат. electus - избранный). Это питательные
среды для избирательного выделения и накопления микроорганизмов определенного вида из материалов, содержащих несколько видов микробов. Элективные среды чрезвычайно многообразны по своему составу. В них включают компоненты, обеспечивающие преимущественный рост искомого микроорганизма и
(или) подавляющие в той или иной степени рост сопутствующей
микрофлоры. По консистенции среды данного типа могут быть
плотными и жидкими. Жидкие элективные среды называют средами обогащения или накопления, их применяют, когда ставят

цель увеличить количество искомого микроорганизма в смешанной популяции.

Молочно-солевой агар предназначен для избирательного культивирования стафилококков. К расплавленному МПА с рН 7,2...7,4, содержащему 5...7,5 % хлорида натрия, до­бавляют 10 % стерильного обезжиренного молока, перемешива­ют и разливают в чашки Петри.

Среда Шустовой предназначена для выделения саль­монелл. Представляет собой МПА (рН 7,4) с добавлением 10 % к объему среды 50%-го водного раствора тиосульфата натрия и 2 % раствора Люголя.

Среда Раппопорт предназначена для культивирова­ния сальмонелл. К МПБ добавляют 1 % глюкозы, 10 % желчи, 1 % индикатора Андрэдэ. Стерилизуют текучим паром.

Среда Мюллера предназначена для культивирования сальмонелл. В колбу с 4,5 г стерильного мела наливают 90 мл МПБ, стерилизуют в автоклаве при 120 "С 30 мин. Затем стериль­но добавляют 2 мл раствора Люголя и 10 мл раствора тиосульфата натрия (тиосульфат натрия - 50 г, дистиллированная вода - 100 мл), стерилизуют в аппарате Коха 30 мин.

Среда Кауфмана - это среда обогащения для сальмо­нелл. К 100 мл среды Мюллера добавляют 1 мл водного раствора бриллиантового зеленого, разведенного 1: 1000, и 5 мл стериль­ной бычьей желчи. Смесь стерилизуют текучим паром 30 мин.

Казеиново-угольный агар (КУА) с пеницилли­ном используют для культивирования бордетелл. К 1000 мл дис­тиллированной воды добавляют гидролизат казеина - 20 мл, хлорид натрия - 5 г, хлорид калия - 0,2 г, хлорид кальция - 0,002 г, карбонат натрия - 0,4 г, хлорид магния - 0,025 г, гидро­фосфат калия - 0,24 г, растворимый крахмал - 1 г, цистин - 0,01 г, агар -20 г. Компоненты растворяют, устанавливают рН 7,2, стерилизуют при 0,5 атм 30 мин. Перед употреблением в рас­плавленный агар (50 °С) добавляют 3 % дрожжевого экстракта и 0,2 % сухого активированного угля и 0,5 ЕД/мл пенициллина. Компоненты перемешивают и разливают по чашкам Петри.

Дифференциально-диагностические среды. Предназначены для выявления ферментов у микроорганизмов. По консистенции мо­гут быть жидкими, полужидкими, плотными. В состав этих сред входят основная питательная среда, обеспечивающая рост изуча­емого микроорганизма, субстрат для обнаружения фермента и индикатор, по изменению цвета которого судят о сдвиге рН сре­ды в результате расщепления субстрата.

К питательным средам такого типа относят среды Гисса, Эндо, Плоскирева, Левина и др.

Среды Гисса используют для изучения ферментатив­ных свойств выделенных культур микроорганизмов. К 100 мл ди­стиллированной воды добавляют 1 % пептона, 0,5 г хлорида на­трия. Компоненты растворяют, фильтруют через бумажный фильтр, устанавливают рН 7,0...7,4, добавляют один из углево­дов-субстратов (лактоза, глюкоза и т.д.), агар-агар (0,3...0,4 %), а затем 1мл индикатора Андрэдэ или 0,1мл 1,6%-го раствора бромтимолового синего. Готовую среду разливают по 3 мл в про­бирки, стерилизуют текучим паром три дня подряд по 30 мин или при 112 °С 20 мин.

Выпускают сухие среды Гисса с индикатором BP - смесь вод­но-голубого с розоловой кислотой (готовые среды - полужидкой консистенции).

Плотные дифференциально-диагностические среды применя­ют для первичной изоляции возбудителей из материала. В их со­став нередко кроме известного субстрата входят вещества, при­дающие питательной среде селективные свойства.

Среда Эндо содержит лактозу в качестве субстрата и предназначена для дифференциации бактерий, различающихся по способности расщеплять лактозу.

К 1000 мл расплавленного МПА (рН 7,4) температурой 70 °С добавляют 1 г лактозы, предварительно растворенной в неболь­шом количестве дистиллированной кипяченой воды. В отдель­ных пробирках готовят: 2...3 мл спиртового раствора основного фуксина; 10 мл 10%-го водного раствора сульфата натрия.

В стерильную пробирку вносят 1 мл раствора фуксина и до­бавляют раствор сульфита натрия до обесцвечивания фуксина. Приготовленную смесь вливают в расплавленный агар, переме­шивают и разливают по чашкам Петри. Готовая среда бесцветна, при росте на ней микроорганизмов, расщепляющих лактозу, сре­да закисляется, обесцвеченный фуксин восстанавливается, и ко­лония микроорганизма, например эшерихий, приобретает крас­ный цвет с металлическим оттенком. Среду готовят за сутки до ее использования. Выпускают также сухую среду Эндо. Перед упот­реблением определенную навеску порошка вносят в дистиллиро­ванную воду, кипятят и разливают по чашкам Петри.

Среда Левина аналогична по целевому назначению среде Эндо, но содержит другой индикатор (эозин с метилено-вым синим). К 100 мл расплавленного МПА (рН 7,2...7,4) добав­ляют 2 мл 0,5%-го водного раствора метиленового синего, 1,5 мл 2%-го раствора эозина желтого, 2 г лактозы, 0,2 г дигидрофосфата калия. Растворы красителей готовят на дистиллированной воде, стерилизуют текучим паром 60 мин. Лактозу и дигидрофос-фат калия предварительно разводят в небольшом количестве сте­рильной дистиллированной воды и кипятят. Колонии лактозопо-зитивных бактерий на этой среде окрашены в фиолетово-черный цвет.

Агар Плоскирева предназначен для выделения саль­монелл, содержит лактозу в качестве субстрата и компоненты, подавляющие рост сопутствующей микрофлоры. Среду выпуска­ют в виде порошка, в ее состав кроме питательной агаровой ос­новы входят: желчные соли, цитрат натрия, тиосульфат натрия, фосфат натрия, бриллиантовый зеленый, кальцинированная сода, йод, хлорид натрия, лактоза, нейтральный красный. Навес­ку порошка растворяют в воде, кипятят и разливают в чашки Петри. Готовая среда прозрачная или розоватая. Колонии саль­монелл бесцветные, эшерихий - брусничного цвета.

Методы культивирования микроорганизмов. Наряду с общими принципами культивирование микроорганизмов различных фи­зиологических групп имеет некоторые особенности Культивирование аэробных и факультативно-анаэробных бак­терий. Плотные, жидкие или полужидкие питательные среды, засеянные чистыми культурами микроорганизмов или исследуе­мым материалом, помещают в термостаты (рис. 34), поддержива­ющие оптимальную для данного микроорганизма температуру. При температурах, превышающих верхнюю границу нормы, бак­терии не только замедляют рост, но и быстро гибнут. При темпе­ратуре ниже оптимальной скорость роста микроорганизма посте­пенно замедляется.

У мезофилов температурный оптимум находится в интервале 30...37 ºС, у психрофилов - 10... 15 ºС, у термофилов - 50...60 ºС.

Микроорганизмы в процессе культивирования на питатель­ных средах при условии, что в среды не вносят дополнительные вещества, постепенно замедляют и затем прекращают свой рост из-за истощения питательного субстрата, изменения оптималь­ных значений биофизических показателей (рН, Eh и т.д.). Такое культивирование микроорганизмов называют периодическим. Если при этом жидкую питательную среду в процессе инкубирования посевов не перемешивают, то такой способ куль­тивирования определяют как стацио­нарный. При диагностических бакте­риологических исследованиях обыч­но используют именно такой способ культивирования. В биологической промышленности при производстве вакцин и других биопрепаратов, ког­да необходимо достичь максимально­го выхода бактериальной массы или экзотоксинов, применяют периодическое культивирование в жидких средах с их интенсивным перемешиванием.

При таких задачах аэробные бактерии культивируют в колбах, бутылях на шюттель-аппаратах с частотой колебания 150... 250 мин-1, что облегчает передачу бактериям кислорода и пита­тельных компонентов.

Рис. 35. Схема ферментера для глубинного культивирования аэробных микроорганизмов.

1 – вход воздуха; 2 – выход воздуха; 3 – отбойники; 4 – мешалка; 5 - барботер

Наиболее эффективное культивирование бактерий в жидких питательных средах с максимальным выходом биопродукта дос­тигают в ферментерах. Ферментеры (реакторы) представляют со­бой металлические или стеклянные культуральные сосуды емко­стью от 500 мл до 1000 л (рис. 35). При культивировании бакте­рий в ферментерах среду перемешивают специальными мешал­ками с одновременной подачей необходимого количества стерильного воздуха. Ферментеры конструируют как автономные системы с автоматической регуляцией температуры и рН среды. В ферментерах также осуществляют непрерывное (проточное) культивирование, при котором в отличие от периодической куль­туры автоматически в среду подаются свежие питательные ком­поненты со скоростью, равной удалению аналогичного объема выросшей культуры бактерий. Такое непрерывное культивирова­ние в хорошо отрегулированной системе в принципе можно про­должать неограниченно долго.

Культивирование анаэробных бактерий. Облигатные анаэро­бы - бактерии, у которых энергетический и конструктивный ме­таболизм происходит без молекулярного кислорода 02. У таких микроорганизмов в процессе дыхания конечными акцепторами

электронов являются окись углерода (IV), ионы сульфата, фумарат и др. Кроме того, молекулярный кислород действует на многие анаэробы губительно. Например, строгие анаэробы погибают при незначительных концентрациях кислорода (бактероиды, фузобак-терии), умеренные анаэробы менее чувствительны (С. perfringens ), аэротолерантные анаэробы могут расти в условиях обычной ат­мосферы (молочнокислые бактерии). Большинство болезнетвор­ных анаэробов относят к строгим или умеренным анаэробам. Для их культивирования используют специальные питательные среды и газовые смеси. Последними наполняют анаэростаты.

Необходимое условие роста облигатных анаэробов - не столько отсутствие молекулярного кислорода, сколько низкий ОКВП питательных сред. Резко восстановительных условий достигают, добавляя в среды редуцирующие (восстанавливающие) вещества и одновременно удаляя из них молекулярный кисло­род. В качестве редуцирующих веществ в питательные среды добавляют химические соединения, приведенные в таблице 1.

1. Восстанавливающие вещества для культивирования анаэробов

С этой же целью в питательные среды вносят вареные кусоч­ки печени, мышц, мозга, кровяные сгустки, куриный яичный бе­лок, зерна ржи. Считают, что в этих тканях сильное редуцирую­щее действие оказывают вещества, богатые SH-группами.

Для создания условий анаэробиоза питательные среды макси­мально освобождают от кислорода путем кипячения, а также пропуская через жидкие среды инертные газы или наслаивая на поверхность питательной среды вазелиновое масло для предотв­ращения контакта с кислородом воздуха.

Мясо-пептонный печеночный бульон (МППБ) Китта-Тароцци - традиционная среда для культиви­рования анаэробов. Ее основой служит печеночная вода, кото­рую готовят путем кипячения в воде мелких кусочков говяжьей печени (соотношение 1:1). Печеночную воду смешивают с МПБ в соотношении 1:2, смесь кипятят, устанавливают необходимый рН и разливают в пробирки по 10 мл. В пробирки добавляют ку­сочки вареной печени (восстановитель) и затем вносят по 2 мл вазелинового масла. Автоклавируют при 0,5 атм 20 мин. Перед употреблением пробирки со средой кипятят в водяной бане, за­тем охлаждают и только после этого проводят посев.

Для выращивания анаэробов используют также питательные среды с повышенной вязкостью, поскольку диффузия кислорода в них затруднена.

Полужидкий агар: к МПБ добавляют 0,25...0,75 % агара, 1 % глюкозы, устанавливают рН 7,4, разливают в пробирки высоким столбиком и дробно стерилизуют.

Практикуют культивирование анаэробов в толще плотных сред.

Сахарный агар в трубках Вейона: к 2%-му МПА добавляют 1 % глюкозы, устанавливают рН 7,4. Посевной материал вносят в расплавленную и охлажденную до 48...50 "С среду, перемешивают и разливают по стерильным узким стек­лянным трубкам - трубкам Вейона (длина 20...25 см, диаметр 1...1,5 см). Концы трубок закрыты стерильными резиновыми пробками. Колонии анаэробов вырастают в толще питательной среды.

Широко применяют культивирование анаэробов на поверхно­сти плотных питательных сред в чашках Петри.

Из числа плотных сред для культивирования анаэробов до­вольно часто используют кровяной агар с глюкозой и железо-сульфитный агар.

Глюкозо-кровяной агар: к 3%-му МПА (рН 7,2...7,4), расплавленному и охлажденному до 50°С, добавляют 1...2% стерильного раствора глюкозы, 15...20% дефибриниро-ванной крови барана и разливают по чашкам Петри.

Железо-сульфитный агар (среда Вильсон-Блера): к 100 мл 3%-го МПА (рН 7,4) с 1 % глюкозы при температуре 60 °С добавляют 10 мл 20%-го раствора сульфита натрия и 1мл 8%-го раствора хлорида железа, затем среду разливают по чаш­кам Петри. Анаэробы при росте на этой среде восстанавливают сульфит натрия до сульфата натрия, который реагирует с хлори­дом железа, образуя черный осадок сульфита железа; колонии бактерий окрашены в черный цвет.

Для культивирования анаэробов на поверхности плотных пи­тательных сред недостаточно добавления в них восстанавливаю­щих агентов. Культуральные сосуды с посевами помещают в гер­метические камеры (анаэростаты), в которых тем или иным спо­собом создают анаэробные (бескислородные) условия.

Обычный анаэростат представляет собой металлический ци­линдр, который герметически закрывает крышка с резиновой прокладкой (рис. 36). На крышке размещены манометр и краны для откачивания воздуха или наполнения анаэростата инертным газом (азот). Воздух откачивают с помощью вакуумного насоса, закручивают вентиль и анаэростат с пробирками или чашками помещают в термостат. Обычное остаточное давление в анаэро-стате около 10 мм рт. ст. Созданы анаэростаты, удаление кисло­рода из которых происходит за счет его реакции с водородом в

присутствии катализатора (платино­вый, палладиевый). Водород в камеру закачивают из баллона через редук­тор. Некоторые анаэробные камеры снабжены нагревательными элемен­тами с терморегулирующим устрой­ством, обеспечивающим автономное поддержание температуры на необхо­димом уровне.

Культивирование микроаэрофильных бактерий. Хотя микроаэрофильные бактерии по типу дыхания аэро­бы, они растут не в обычной атмос­фере (21 % кислорода), а с понижен­ным содержанием кислорода. Например, Campylobacter fetus рас­тет в атмосфере, содержащей не более 6 % кислорода. Такую ат­мосферу можно создать в герметичных термостатах, анаэростатах, заменяя часть воздуха сжатым оксидом углерода (IV) из бал­лона, или в обычном эксикаторе. В последнем случае пробирки с посевами помещают в эксикатор вместе с бюксом, содержащим ватку, смоченную спиртом, или свечу. Вату (свечу) зажигают и закрывают крышку эксикатора. Пламя затухает по мере выгора­ния кислорода, и снижение его содержания достаточно для роста микроаэрофилов.

Наиболее доступен и эффективен способ культивирования микроаэрофилов в полужидкой среде с 0,1...0,4 % агара. В такой среде конвекционные потоки не способны перемешивать верхние, богатые кислородом слои среды с нижними, что создает в среде, заполняющей пробирку, градиент концентрации кислоро­да. Культуру микроаэрофила засевают уколом, и микроорганизм растет в зоне с оптимальным содержанием кислорода, обычно в виде тонких дисков на расстоянии от нескольких миллиметров до нескольких десятков миллиметров от поверхности среды.

Культивирование грибов. Лучший рост грибов отмечен на сре­дах с содержанием углеводов 1...4%. При первичной изоляции для подавления роста различных сопутствующих бактерий в пи­тательные среды часто добавляют антибиотики.

Агар Сабуро применяют для культивирования возбуди­телей дерматомикозов и кандидамикоза. Глюкоза -4 г, пеп­тон - 1 г, агар - 1,8 г, дистиллированная вода - 100 мл. После растворения агара среду фильтруют, разливают по пробиркам и стерилизуют при 0,5 атм 30 мин. После стерилизации рН среды 6,9...7,0.

Агар Чапека используют для культивирования грибов многих видов. Глюкоза - 30 г, нитрат натрия - 2 г, дигидрофос­фат калия - 1, сульфат магния - 0,5 г, хлорид калия - 0,5 г, сульфат железа -0,0012 г, агар -20 г, дистиллированная вода - 1000 мл. Естественный рН среды 5,6...5,9. Среду стерилизуют при 0,5 атм 30 мин.

Сусло-агар предназначен для культивирования возбу­дителей дерматомикозов и кандидамикоза. Солодовое неохме-ленное сусло разбавляют водопроводной водой в соотношении 1: 2 (до содержания Сахаров 7 %), устанавливают рН 6,5...6,7, до­бавляют 2 % агара, кипятят, фильтруют, стерилизуют при 0,5 атм 30 мин.

Агар Литмана пригоден для культивирования дерматофитов. Пептон - 10 г, глюкоза - 10 г, бычья желчь - 15 г, кристаллвиолет -0,01 г, агар -20 г, дистиллированная вода- 1000 мл. Среду стерилизуют при 1 атм 15 мин.

Среда Ван-Итерсона предназначена для выделе­ния из кормов токсичных грибов, вызывающих стахиботриотоксикоз, дендродохиотоксикоз и др. Нитрат аммония - 0,5 г, ди­гидрофосфат калия - 0,5 г, водопроводная вода - 1000 мл. Среду стерилизуют при 1 атм 30 миц. Затем средой увлажняют стериль­ные чашки Петри с фильтровальной бумагой.

Жидкая среда Чапека. Глюкоза - 30г, нитрат на­трия - 2 г, дигидрофосфат калия - 1 г, сульфат магния - 0,5 г, хлорид калия -0,5 г, сульфат железа - 0,001 г, дистиллирован­ная вода - 1000 мл. Среду стерилизуют при 0,5 атм 30 мин. После стерилизации рН среды 5,9...6,2. Жидкую среду можно использо­вать для увлажнения фильтровальной бумаги в чашках Петри с целью последующего культивирования грибов.

Среда Билай предназначена для получения макроко­нидий грибов. Нитрат калия - 2 г, дигидрофосфат калия - 1 г, сульфат магния -0,5 г, хлорид калия -0,5 г, сульфат железа - следы, крахмал растворимый - 0,1 г, сахароза - 0,1 г, глюкоза - 0,1 г, дистиллированная вода - 1000 мл. Среду разливают по про­биркам по 5 мл и в каждую пробирку вставляют полоску фильт­ровальной бумаги таким образом, чтобы большая часть ее нахо­дилась над раствором. Среду стерилизуют при 1 атм 20 мин.

Глюкозный бульон Сабуро используют для культивирования грибов многих видов. Глюкоза - 40 г, пептон - Юг, дистиллированная вода- 1000мл. Нагревают до кипения, разливают по пробиркам и стерилизуют при 1 атм 15 мин.

Культивирование на волосах по Ван-брейзегему применяют при выделении дерматофитов. Здоровые стерильные волосы прикрепляют коллодием к стек­лянной трубочке. На середину волос наносят культуру гриба. Трубочку помещают в цилиндр, на дно которого для влажности наливают небольшое количество воды. Культивируют при 25 "С пять-десять дней и более.

Для выделения возбудителей гистоплазмоза, эпизоотического лимфангита применяют кровяной агар.

ЗАДАНИЯ ДЛЯ САМОСТОЯТЕЛЬНОЙ РАБОТЫ

1. Приготовить скошенный МПА, сывороточный и кровяной
МПА.

2. Изучить устройство анаэростата и ферментера.

Контрольные вопросы

1.Какие общие требования предъявляют к питательным средам?

2.На какие группы классифицируют питательные среды?

Как культивируют анаэробы и микроаэрофилы

Питательные среды являются основой бактериологических исследований. Они служат для выделения из исследуемого материала чистых культур микробов, для изучения их свойств. На питательных средах создаются оптимальные условия для размножения микроорганизмов. В состав сред должны входить вещества, необходимые для построения всех компонентов цитоплазмы, т.е. все источники роста живого организма. Сюда, в первую очередь, относятся источники азота, углерода, водорода и кислорода.

Источник водорода и кислорода в питательных средах - вода. Источником азота служат органические соединения, которые получают из мяса, рыбы, плаценты, молока, яиц, крови. В результате гидролиза панкреатином или трипсином из этих продуктов получаются т.н. гидролизаты, содержащие большое количество аминокислот и пептонов, которые хорошо усваиваются большинством микроорганизмов. Нативный белок усваивают только некоторые микроорганизмы, имеющие экзопротеазы. Гидролизаты являются основой для приготовления сред для многих микроорганизмов.

Источником углерода для патогенных микробов являются, главным образом, различные углеводы: моно- и дисахара, многоатомные спирты, органические кислоты и их соли.

Кроме органогенов, бактериям необходимы неорганические соединения, содержащие фосфор, калий, серу, натрий, магний, железо, а также микроэлементы: кобальт, йод, марганец, бор, цинк, молибден, медь и др.

Потребность микроорганизмов в неорганических соединениях удовлетворяется прибавлением к питательной среде солей КН2РO4 К2НРO4 и др. Микроэлементы, выполняющие роль катализаторов химических процессов, необходимы в ничтожно малых количествах и поступают в питательную среду с пептоном, неорганическими солями и водой. Наряду с перечисленными органическими элементами, многие микроорганизмы нуждаются в факторах роста, т.е. в веществах, которые они сами не могут синтезировать. Факторы роста необходимо добавлять в питательные среды в готовом виде. К факторам роста относятся различные витамины, источником которых в питательных средах являются прибавленные к питательной среде продукты растительного и животного происхождения, содержащие в своем составе никотиновую, пантотеновую, парабензойную кислоты, витамины А, В, С и др.

Питательные вещества микробами могут усваиваться только при определенной реакции среды, т.к. проницаемость оболочек микробных клеток изменяется в зависимости от рН среды.

Требования, предъявляемые к питательным средам.

1. Питательные среды должны содержать необходимые для питания микробов питательные вещества.

2. Иметь реакцию рН, оптимальную для выращиваемого вида микроба. -

3. Питательные среды должны иметь достаточную влажность и вязкость, т.к. микробы питаются по законам диффузии и осмоса.

4. Обладать изотоничностью и иметь определенный окислительно-восстановительный потенциал (гН2).

5. Питательные среды должны быть стерильными, обеспечивая тем самым возможность выращивания чистых культур.

Потребность в питательных веществах и физических условиях у различных видов микробов неодинакова, и этим исключается возможность создания универсальной питательной среды.

По консистенции различают плотные и жидкие питательные среды. Плотные готовят на основе жидких посредством прибавления к ним клеевых веществ: агар-агара или желатина! Агар-агар (по-малайски - желе) - продукт растительного происхождения, добывается из морских водорослей. В воде агар-агар растворяется при температуре 80-86°С, затвердевает при 36-40, и поэтому используется для уплотнения питательных сред для выращивания разных групп микроорганизмов при оптимальной для них температуре.

Классификация питательных сред производится по их составу и назначению

1.По составу питательные среды делятся на простые и сложные

Различают группу сред общего назначения - простых. К этой группе относят мясо-пептонный бульон (простой питательный бульон), мясо-пептонный агар {простой питательный агар), питательный желатин. Эти среды применяются для выращивания многих патогенных микробов. Среды общего назначения, или простые питательные среды, готовятся обычно из гидролизатов с добавлением пептона и хлористого натрия. Их используют также как основу для приготовления сложных сред.

2.Ко второй группе относятся среды элективные, специальные и дифференциально-диагностические.

Среды элективные (селективные, избирательные, накопления, обогащения). Принцип создания элективных питательных сред основан на удовлетворении основных биохимических и энергетических потребностей того вида микроба, для культивирования которого они предназначены, или на добавление ингибиторов, подавляющих рост сопутствующей микрофлоры. Определенный состав и концентрация питательных веществ, микроэлементов, ростовых факторов при строго определённом значении pH или добавлении ингибиторов обеспечивают оптимальные условия для выращивания одного или нескольких видов микроорганизмов. При посеве на них материала, содержащего смесь различных микробов, раньше всего будет провялятся рост того вида, для которого среда будет элективной. Примером элективных сред являются желточный бульон, селенитовый бульон, среда Плоскирева – для выращивания микробов семейства кишечных, щелочная пептонная вода – для холерного вибриона.

Желточный бульон. К МПБ добавляют 10-20% бычьей желчи. Желчь подавляет рост коков и воздушной флоры, но благоприятна для размножения сальмонелл.

Селенитовый бульон. Состоит из фосфатного бульона с добавлением натриевой соли селенита, которая является ингибитором роста кокковой флоры, кишечной палочки, но не задерживает роста сальмонелл.

Среда Плоскирева. Плотная среда, содержащая ингибиторы кишечной палочки, коков, но благоприятная для роста шигелл и сальмонелл, размножение которых не тормозится бриллиантовым зелёным и желчными солями.

Пептонная вода. Содержит 1% пептона и 0,5% хлористого натрия. Среда является элективной для хлорных вибрионов, т.к. они лучше других бактерий размножаются на “голодных средах”, особенно при щелочной реакции, потому что сами выделяют кислые продукты жизнедеятельности.

Специальные среды. Необходимы для культивирования бактерий, не растущих на простых питательных средах. Для некоторых организмов к простым питательным средам необходимо добавлять углеводы, кровь и др. дополнительные питательные вещества. Примерами простых питательных сред являются сахарный бульон и сахарный агар для стрептококка (готовится соответственно из МПБ и МПА, к которым добавляется 0,5-2% глюкозы).

Для пневмококков и менингококков специальной средой являются сывороточный бульон и сывороточный агар (для приготовления сывороточного бульона смешивают 1 часть МПБ с 2 частями свежей сыворотки, для получения, сывороточного агара к расплавленному МПА добавляется 10-25% стерильной лошадиной или бычьей сыворотки).

Дифференциально-диагностические среды используют для определения видовой принадлежности исследуемого микроба, основываясь на особенностях его обмена веществ». По своему назначению дифференциально-диагностические среды разделяют следующим образом:

1. Среды для выявления протеолитической способности микробов, содержащие в своем составе молоко, желатин, кровь и т.д.

2. Среды с углеводами и многоатомными спиртами для

обнаружения различных сахаролитических ферментов.

В состав дифференциально-диагностических сред, предназначенных для выявления сахаролитических свойств и окислительно-восстановительных ферментов, вводят индикаторы: нейтральную красную, кислый фуксин, бромтимоловый синий, водный голубой с розовой кислотой (ВР). Изменяя свою окраску при различных значениях рН, индикатор указывает на наличие фермента и расщепление введённого в среду ингредиента.

Примеры дифференциально-диагностических сред:

Среда Эндо. Состоит из МПА с добавлением 1% лактозы и обесцвеченного сульфитом натрия основного фуксина (индикатор). Среда Эндо имеет слаборозовый цвет. Используется в диагностике кишечных инфекций для дифференциации бактерий, разлагающих лактозу с образованием кислых продуктов, от бактерий, не обладающих этой способностью. Колонии лактозонозитивных микробов (кишечная палочка) имеют красный цвет вследствие восстановления фуксина. Колонии лактозонегативных микроорганизмов - сальмонелл, шигелл и др. -бесцветны.

К дифференциально-диагностическим средам относятся короткий и развёрнутый пёстрый ряд. Он состоит из сред с углеводами (среды Гисса), МПБ, молока, мясопептонной желатины.

Среды Гисса готовятся на основе пептонной воды, к которой прибавляются химически чистые моно-, ди- или полисахариды (глюкоза, лактоза, крахмал и др.).

Для обнаружения сдвигов рН в результате образования кислот и разложения углевода в среды прибавляют индикатор. При более глубоком расщеплении углеводов образуются газообразные продукты (СО2, СН4 и др.), которые улавливаются при помощи поплавков - маленьких пробирочек, опущенных в среду кверху дном. Среды с углеводами могут готовиться и плотными – с добавлением 0,5-1% агар-агара. Тогда газообразование улавливается по образованию пузырьков (разрывов) в столбике среды.

На МПБ, входящем в пёстрый ряд, обнаруживают продукты, образующиеся при расщеплении аминокислот и пептонов (индол, сероводород). Сероводород обнаруживается путем помещения в МПБ после засева культуры полоски фильтровальной бумаги, пропитанной раствором уксуснокислого свинца. При расщеплении аминокислот, содержащих серу, выделяется сероводород, бумажка чернеет за счёт образования сернистого свинца. Для определения индола можно использовать сложный индикатор. Индол образуется при расщеплении триптофана, и его можно обнаружить при добавлении к культуре, выращенной на МПБ, этого индикатора. При наличии индола МПБ окрашивается в зеленый или синий цвет.

Сухие среды.

Питательный агар, а также основные дифференциально-диагностические среды выпускаются в настоящее время в виде сухих препаратов, содержащих все необходимые составные части. К таким порошкам нужно добавить только воду и сварить, а затем, после разливки, простерилизовать.